探究不同濃度的臭氧水對非洲豬瘟病毒的殺滅效果

　　非洲豬瘟論文第四篇：探究不同濃度的臭氧水對非洲豬瘟病毒的殺滅效果

　　摘要：生物安全仍是當前防控非洲豬瘟的最重要措施。然而，在豬場的各個生物安全環節中，對員工食材的消毒尚未見較好的方法。臭氧消毒是多場景中均可使用的消毒方式。因此，為了探究臭氧溶于水后對非洲豬瘟病毒（ASFV）的殺滅效果，試驗通過臭氧水與ASFV的作用后的紅細胞吸附（HAD）試驗來判定臭氧水對ASFV的殺滅效果。試驗結果顯示：10 m L濃度為2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水與100μL的3.0×104拷貝數的ASFV作用2 min、5 min和10 min時，HAD結果均為陰性，表明2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水作用于100μL的3.0×104拷貝數的ASFV 2 min、5 min和10 min時，均可完全殺滅病毒。以上試驗表明，臭氧水在不同作用時間下對ASFV具有較好的殺滅效果。

　　關鍵詞:臭氧;非洲豬瘟病毒;殺滅效果;

　　非洲豬瘟（African Swine Fever,ASF）是由非洲豬瘟病毒（African Swine Fever Virus,ASFV）引起的急性、烈性和高度接觸的傳染性疾病[1]。2007年以前，ASF在撒哈拉以南國家流行，隨后一株高度毒力的ASFV被帶到高加索地區，開始在東歐和俄羅斯傳播[2]。2018年8月，ASF在中國的東北部暴發，隨后席卷全國，對經濟社會產生巨大影響[3]。ASF被世界動物衛生組織設定為法定報告的動物疫病，而且屬于我國重點防范的一類動物疫情。ASFV是非洲豬瘟相關病毒科（Asfarviridae）非洲豬瘟病毒屬（Asfivirus）的唯一成員，也是唯一的蟲媒DNA病毒，其基因組為雙鏈DNA，大小為170 kb～190 kb之間，病毒粒子的外形近似六邊形，直徑約200 nm[4]。軟蜱是ASFV的重要傳播媒介，最早在非洲東部和南部的發現，沒有攜帶ASFV的軟蜱，由于叮咬攜帶ASFV的病豬，也會成為ASFV潛在的傳染源，再次叮咬陰性疣豬時，使其感染ASFV。ASFV在野生豬群中通過蜱作為中間宿主在豬群傳播[5]。同時ASFV也可以通過空氣或附著在ASFV污染物的表面進行傳播[6]。ASFV可以引起家豬和野豬特征性出血和發熱，臨床癥狀表現為發燒、皮膚發紺和多臟器廣泛性出血，強毒株感染時死亡率高達100%。由于ASFV的對機體免疫機制的影響極為復雜，基因型多，因此沒有有效疫苗用于防控[7]。ASFV作為最具破壞性的病毒之一，對動物健康、國民經濟和人民生活構成巨大威脅。目前我國養殖業針對ASFV采取的措施主要是以預防為主，在豬場原材料和人工等方面嚴格把控，一切原材料進入豬場之前進行嚴格的殺菌和消毒，以控制ASFV的傳入。消毒劑作為殺滅ASFV常用的主要消毒產品在豬場被廣泛使用。而臭氧作為消毒劑具備以下幾個特點。首先，臭氧是一種廣譜殺菌劑，可殺滅細菌繁殖體和芽孢、病毒、真菌等，且臭氧在水中殺菌速度是液氯的3000倍以上。其次，臭氧殺菌速度是急速的，當濃度超過一定閾值后，消毒殺菌甚至可以瞬間完成。并且臭氧利用其強氧化性能消毒，不產生有害生成物，剩余臭氧會自行分解為氧氣，因而不產生殘余污染[9]。臭氧氣體和臭氧水消毒為臭氧常見的消毒方式，應用控制簡單、方便、經濟。由于臭氧特有的優勢，其在食品處理中有很多附加價值，如無須使用化學藥劑，沒有化學副產物，減少成本支出，使用環境更安全�；�于臭氧的這些特點，食品行業采用高濃度臭氧水進行食品殺菌，主要應用于員工洗手消毒、食品行業器械消毒、大小型蔬果處理廠、食品加工業和定點清潔。因此，為了探究將臭氧消毒應用于豬場內食品的消毒是否切實可行，本試驗模擬了豬場內員工食材消毒場景，初步探究了不同濃度的臭氧水對ASFV殺滅效果。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

　　ASFV病毒粒子、豬紅細胞、PAMs細胞、96孔細胞培養板、1640培養基、胎牛血清、臭氧水機：“瑞凈活氧水機”（DT-01C、12W）、“杭州陸恒生物”臭氧水濃度檢測儀M900。

　　1.2 方法

　　1.2.1 臭氧水機不同作用時間下臭氧水濃度變化

　　啟動臭氧水機，將水槽內注滿自來水，在不同作用時間后，使用“杭州陸恒生物”臭氧水濃度檢測儀M900測定臭氧水濃度，探究臭氧水隨時間變化曲線。

　　1.2.2 探究震蕩對臭氧水濃度的影響

　　將3.0 ppm臭氧水取出裝至50 m L離心管內，漩渦震蕩15 s，使用“杭州陸恒生物”臭氧水濃度檢測儀M900測定臭氧水濃度，探究臭氧水濃度隨著震蕩時間變化曲線，探究震蕩是否能夠消除水中溶解的臭氧。

　　1.2.3 臭氧水殺滅ASFV效果探究

　　探究不同臭氧水對ASFV殺滅效果的試驗分為三組：試驗組，陽性對照組和陰性對照組。試驗組：2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水10 m L與病毒懸液（病毒拷貝數為3.0×104）分別作用2 min、5 min和10 min。病毒陽性對照組：無菌水10 m L與100μL的病毒懸液（病毒拷貝數為3.0×104）分別作用2 min、5 min和10 min。作用結束后，震蕩去除水中溶解的臭氧，再接種于提前鋪有PAMs細胞的96孔細胞培養板，孵育2 h后，置37℃二氧化碳培養箱中培養。病毒陰性對照組：無菌水10 m L震蕩，再接種于提前鋪有PAMs細胞的96孔細胞培養板，每個實驗組設置8個重復，孵育2 h后，置37℃二氧化碳培養箱中培養。分別向上述三組不同處理實驗組中加入豬紅細胞，觀察是否存在紅細胞吸附現象。以上涉及ASFV活病毒的試驗均在華南農業大學動物生物安全三級實驗室內開展。

　　2 試驗結果

　　2.1 臭氧水機不同作用時間下水中臭氧濃度變化

　　臭氧水機不同作用時間下水中臭氧濃度變化（方差S2為1.0506）如圖1所示，隨著臭氧水機的開啟，水中臭氧濃度逐漸上升，并于45 min時到達5.2 ppm,45 min后，在臭氧水機開啟的情況下水中臭氧濃度一直保持在5.0 ppm以上。

　　圖1 臭氧水機不同作用時間下水中臭氧濃度變化曲線   

　　2.2 震蕩對臭氧水濃度的影響

　　震蕩對臭氧水濃度的影響（方差S2為1.02164）如圖2所示，隨著漩渦震蕩時間的增加，臭氧水的濃度逐漸降低，并于75 s接近0 ppm，表明震蕩可有效去除水中溶解的臭氧，可用于中止臭氧反應試驗。

　　圖2 臭氧水濃度隨著震蕩時間變化曲線  

　　2.3 臭氧水殺滅ASFV效果探究

　　臭氧水殺滅ASFV的結果如表1所示：陰性對照（空白對照組）HAD結果為陰性，表明試驗過程操作嚴謹，試驗無污染。陽性對照（病毒組）與無菌水作用2 min、5 min和10 min時，HAD結果均為陽性，表明病毒活性良好，試驗切實可行。臭氧水試驗組，10 m L濃度為2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水與100μL 3.0×104拷貝數的ASFV作用2 min、5 min和10 min時，HAD結果均為陰性，表明2.0 ppm、3.5 ppm、5.0 ppm的臭氧水與均100μL3.0×104拷貝數的ASFV作用2 min、5 min和10 min時，均可完全殺滅病毒。

　　表1 臭氧水殺滅ASFV效果探究    

　　注：“-”代表HAD陰性，表示病毒被完全殺滅；“+”代表HAD陽性，表示病毒未被完全殺滅

　　3 討論

　　2018年8月，ASFV入侵我國，隨后政府立即發布了相關防控政策，但ASF仍在一年內迅速蔓延至中國大陸各省。到目前為止，ASF疫情在我國尚未得到完全的控制。ASFV在豬群中的持續感染，大量的豬只被撲殺，引起了豬群數量和生豬產量的劇烈波動，導致豬肉價格的劇烈波動，對我國生豬產業和經濟發展帶來了挑戰。ASF在我國的出現和迅速蔓延，表明我國針對外來動物疾病的生物安全體系存在薄弱環節，因此我們需要提高生物安全意識，完善豬場生物安全體系[8]。目前我國豬場生物安全防控的措施主要從三方面入手：第一，建立良好的生物安全屏障；第二，建立良好的消毒和無害化處理措施；第三，提高豬場工作人員的生物安全意識。良好的消毒措施對于控制ASFV的傳播至關重要。目前國內豬場主要采取消毒劑的方式對豬場進行消毒，主要以強酸、強堿、強氧化劑、季銨鹽和鹵素類消毒劑為主，雖然對病原體有較好的殺滅效果，但大部分消毒劑對豬和人有一定危害，且對豬場內員工食材并非是較好的消毒方法[10]。臭氧作為消毒劑具有高效性、廣譜性、無污染等特點�？紤]到臭氧消毒的優越性，本試驗模擬了豬場內員工食材消毒場景，證實了臭氧水對ASFV有較好的殺滅效果�？梢�，將臭氧水應用于豬場內員工食材的清洗和消毒是一種較優的補充生物安全措施的方式。

　　4 結論

　　試驗表明，臭氧水在不同作用時間下對ASFV具有較好的殺滅效果，可考慮將臭氧水應用于豬場內員工食材的清洗和消毒。

　　參考文獻

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　　[10]孫剛.論養豬場消毒的方法[J]農民致富之友，2018(02):229.